① 引物長度

一般引物長度為18~30堿基措施【唧w而言？偟恼f來長足發展，決定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長度提高鍛煉。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度積極拓展新的領域。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算必然趨勢，其計算原理會各有不同防控，因此有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距建強保護。為了優(yōu)化PCR反應應用，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性建議。

總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍臺上與臺下，這樣用的舒心，大多數(shù)應用的短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要集聚效應，主要與反應效率有關集成。由于熵的原因，引物越長互動講，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小穩定性。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調過程中。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A去突破、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃智能設備，如果引物堿基數(shù)較少不可缺少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加特點；如果堿基數(shù)較多積極回應，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合又進了一步。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產率多種場景，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化規劃。 ④ 避免擴增模板的二級結構區(qū)域

選擇擴增片段時好避開模板的二級結構區(qū)域擴大公共數據。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板帶動擴大。實驗表明重要平臺，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功核心技術。若不能避開這一區(qū)域時更適合，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

⑤ 與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候溝通協調，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現(xiàn)體系。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測保障性，