流式細胞儀技術(shù)大部分，主要是測量群體中單個細胞經(jīng)適當染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點責任製，當每個細胞經(jīng)過焦點時事關全面，發(fā)出一束散射光/或熒光各領域。它們經(jīng)過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態(tài)裝置)相結合，光檢測器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號主要抓手，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進行數(shù)字化后而成整數(shù)高效節能，然后進行電子存儲自行開發，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進行分析進行部署。其優(yōu)點如下：
1、具有操作簡便應用情況，只要將染色的單個細胞推入儀器中保護好，就會得出數(shù)據(jù)。
2表現、具有較高的靈敏度及測定速度運行好，而且每次可測出許多數(shù)據(jù)，一般情況下可能性更大，每秒可測5000個細胞部署安排，能迅速分析和記數(shù)大量細胞，并能準確統(tǒng)計群體中熒光標記細胞的比例技術。
3推廣開來、應用廣泛，即可用于測定細胞活力相對較高、繁殖周期和細胞定型分析資源配置，也可區(qū)別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群相關，既可測定DNA和RNA大力發展、測凋亡峰，又可測蛋白含量生產效率，特別是胞漿蛋白產能提升。
一發展、樣品的制備
流式細胞儀是測定一個或重復的每個顆粒經(jīng)光路的信號，因此總之，細胞必須做成單個細胞懸浮狀態(tài)，不能聚集支撐作用，也不允許有細胞碎片存在研學體驗。所用染料必須特異(如特異單抗)，而且不允許滲透至載液中最為突出。
標本如果是屬于淋巴細胞等血細胞落實落細、骨髓細胞或白血病細胞系或類淋巴細胞系，要經(jīng)Ficoll分離高效化，作單細胞分離處理製高點項目，但若為實體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶範圍和領域、膠原酶等)有所增加，化學法(EDTA、EGTA和檸檬酸鹽)消化分散液或洗液用無鈣更高要求、鎂PBS越來越重要的位置，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時采用機械分散法共同學習，將經(jīng)消化處理的膨松組織不要畏懼，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸問題，過一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100μm和20μm逐漸顯現。細胞濃度要保證在1～2×106/ml。
若標本用于測定單個細胞系統穩定性，需加入1～5mg/L的DNAase拓展基地，將有助于阻止破碎細胞釋放的DNA造成細胞再聚集，但是若分離的細胞要作DNA含量測定之用時培訓，則切勿加DNAase不合理波動。
二、懸浮細胞的固定
上述制備的活細胞即可用于流式細胞儀分析重要工具，如果染色和流式分析要拖后進行積極拓展新的領域，或為了提高染色效果，則要將細胞預固定更優質。乙醇固定是常用的方法相對開放。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在細胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12～18小時脫穎而出。
(2)乙醇法：細胞懸于PBS中拓展應用，緩慢加入-20℃預冷的95%乙醇生產創效，使終濃度為70%，冰浴30分鐘管理。
(3)丙酮法：于細胞懸液中優化上下，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%模樣。
2生產體系、實例：
(1)用預冷的無鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液很重要，將細胞制成1×106細胞的懸液能力和水平。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達70%異常狀況。
(3)該細胞可在4℃下保存數(shù)日研究。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇應用創新，再將細胞懸于PBS中或要求的試劑中提高。
三、流式細胞儀分析的應用
(一)非染色細胞的光散射
一個粒子(如細胞)出現(xiàn)在一束光線中逐漸完善，立即會干擾該光束參與能力，造成該光束入射光的重分布，該細胞所獲能量則以衍散是目前主流、折射充分發揮、反射等復雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來，這些參數(shù)與細胞體積充分發揮、表面構(gòu)象選擇適用、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系，可測低角前面約10°的光散射及90°的光散射設計。
一般認為業務指導，90°位置的光散射值主要受細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細胞大小就此掀開。光散射測量方法如下：
(1)將細胞懸浮于HBSS中長足發展，濃度介于1×106～2×106/ml濃度之間。
(2)以懸浮細胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細胞貯藏池穩步前行。
(3)設定細胞流量為500個/S(秒)結構不合理，以獲得*測定結(jié)果。
(二)染色法
1逐步改善、細胞的碘化丙錠(propiolium iodide意見征詢，PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質(zhì)，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中的必然要求，可使熒光強度增加約20倍研究成果，PI的熒光強度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長激發(fā)完善好，DNA/PI復合物zui大的發(fā)射波長約為615nm大面積。
1.1 小鼠Lewis肺癌細胞(3LL)DNA含量測定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗;
(2)去除結(jié)締組織及脂肪問題分析，剪碎腫塊;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針搖籃，加壓使其通過，于4℃條件下重懸細胞于HBSS中推廣開來。
(4)將200～300μL細胞懸液(5×105細胞/ml)中加入3ml PI(50μg/ml)，染色3LL細胞相對較高，于4℃存放20～30分鐘資源配置。
(5)測定580～750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分大幅增加。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水特性。
1.2 培養(yǎng)細胞DNA的流式細胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次;
(2)加入PI5ml于培養(yǎng)皿中等特點，在4℃放10分鐘;
(3)用吸管反復次打細胞建言直達，使細胞破壞，胞核釋放出來將進一步，再行流式細胞儀分析充分發揮。
1.3 完整細胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細胞懸液，離心成就，去固定液;
(2)室溫條件下加入PI染色一批細胞(105～106細胞/ml)重要方式，時間為30分鐘，然后行流式細胞儀分析系統。
1.4 光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過程中非常重要，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實體腫瘤組織空間廣闊，精子細胞及婦科標本營造一處，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞。
(1)分離制備的細胞懸液即可使用知識和技能，若用70%乙醇固定可保存一周取得顯著成效。
(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時(PI為10mg/L特征更加明顯、光輝霉素為10mg/L)估算。
(3)染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源的可能性，使用BG123nm阻斷濾片不要畏懼，疊加K590型高通濾法(one seep filter)服務為一體。
2、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA逐漸顯現。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定全會精神，非固定細胞核酸，或作溶酶體的一種標記拓展基地。觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細胞和靜止細胞群體集中展示。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復性結(jié)果，但該方法已被許多實驗室廣泛采用分享。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存共享，穩(wěn)定期約2周。
Triton X-100(0.1%0.1ml方式之一，1mol/LHCL 8ml
1mol/LNaCI15ml蒸餾水76ml生動，PH1.5(100ml)
溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，除菌以后(高壓或過濾)貯存創新能力。
0.01mol/LEDTA10ml新品技，1mol/LNaCI15ml
0.4mol/LNa2HPO4 31.5ml，0.2mol/L檸檬酸18.5ml
蒸餾水24ml求得平衡，總體積為99ml紮實做，pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應小心)至關重要，吖啶橙應用液0.1ml母液加9.9ml溶液B稀釋提供深度撮合服務。
注意：儀器鞘流系統(tǒng)應保持4℃。
氬激光激發(fā)波488nm的發生，紅色熒光為DNA(F>600nm)事關全面，綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細胞懸液，取0.2ml(8×106細胞/ml)狀態，加入0.4ml溶液A技術節能，4℃放置45～60秒。
②加1.2ml含吖啶橙的溶液B廣泛認同，室溫2分鐘國際要求。
③應在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進流式細胞儀分析。
注意：①細胞數(shù)保持恒定;②核酸與吖啶橙的比例;③染色時間及溫度鍛造。
(三)染色法的應用
1競爭激烈、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內(nèi)含1000u/ml RNA酶A，0.2mol/LKCl改善，pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5mg/L(16.7μm)空白區，0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液，pH2.6。
①2×106細胞懸于1mlHBSS/RNase液中形勢。
②37℃溫育1小時實踐者。
③將0.2ml細胞懸液(含4×105細胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5ml0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20℃ 30分鐘約定管轄。
④加2ml吖啶橙染色2分鐘數據。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細胞中單鏈及雙鏈DNA含量。
2大幅拓展、DNA與癌基因探針雙標記測定
這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標記癌基因表達產(chǎn)物發行速度，然后用PI標記DNA，現(xiàn)以研究白血病細胞增殖與癌基因的關(guān)系說明操作步驟：
(1)制備白血病細胞懸液與時俱進，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘性能。
(2)取50μl50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras綜合運用，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)組建，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次效果較好，重懸浮于50μlHBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。
(4)加入50μl1：200兔抗鼠IgG持續，4℃放置30～45分鐘等多個領域。
(5)同(3)洗滌后加入50μl1：40的FITC標記的羊抗兔IgG，4℃反應30～45分鐘產品和服務。
(6)同(3)洗滌后應用擴展，細胞用RNA酶消化，室溫20～30分鐘增多。
(7)同(3)洗滌后活動上，用PI染液染20分鐘。
(8)同(3)洗滌后進一步推進，用488nm激發(fā)波長測定導向作用。FITC染色顯示ras癌基因表達產(chǎn)物，PI染色顯示DNA含量應用的選擇。
注意事項：
①制備樣品時十大行動，離心次數(shù)不宜過多，防止細胞丟失和凝集;
②細胞固定時間不宜過長背景下，不要用冰醋酸綜合措施、乙醇、苦咪酸及汞固定劑;
③為了降低本底自然條件，應將細胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈;
④進行雙標記沉淀時設計標準，應盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。
3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細胞周期分析
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33mg/LBrdu及脫氧細胞苷26.4g/ml發揮重要帶動作用。
染色液：Hoechst33258溶于PBS意向，細胞染色24小時后進行分析，據(jù)報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間能力建設。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1：10加入細胞培養(yǎng)液中關註。
②根據(jù)細胞周期時間不同，選擇不同時間培養(yǎng)的細胞無障礙。
③孵育后連日來，搖散細胞以傳代培養(yǎng)。
④直接用染液重懸細胞認為，進入流式細胞儀分析系統。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā)重要意義。應特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對交流等。因此，不僅特異性標記DNA規劃，亦可標記胸腺嘧啶提高。在細胞周期分析時，在與細胞孵育過程加入Brdu進入當下，Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶紮實，因此，處于合成期內(nèi)的細胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)新體系，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰投入力度，此項技術(shù)可用于直接測定細胞G2期及分裂時間。
4不難發現、Hoechst33342染色活細胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342貢獻法治，用蒸餾水配成0.25mol/L。
(2)方法：
①制備106/ml細胞懸液發展需要，以Hoechst33342染色攻堅克難，濃度為5～10mg/L ，室溫下20分鐘顯示。
②分析前切勿洗滌細胞生動。
Hoechst33342可用作細胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細胞活性的同時創新能力，呈現(xiàn)出相當好的DNA化學計量關(guān)系新品技，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處求得平衡。
5深入交流、以異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白質(zhì)引領作用。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40mg/LRNase的PBS配成0.1～1.0mg/L濃度。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細胞臺上與臺下，至少18小時用的舒心。
②離心固定細胞，棄去固定液集聚效應。
③室溫下用FIFC染色細胞蛋白集成，30分鐘。
④流式細胞儀分析互動講，使用氬激光穩定性，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515～535nm過程中。
也可于固定細胞中去突破，以18mg/L(0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質(zhì)雙重染色達到，分別呈現(xiàn)紅色熒光(DNA)和綠色熒光(蛋白質(zhì))智能設備。
6、熒光素抗體的應用
該技術(shù)既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞蓬勃發展，可用熒光素或若丹明標記單克隆抗體處理上述細胞;也可用于測定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白特點，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle’s MEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉重要性、2%牛血清又進了一步。為判定FIFC抗體的zui適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50μl不同濃度的稀釋液服務機製，再以熒光顯微鏡確認*染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時使用，應稀釋成5mg/L或0.25mg/L大幅拓展。無論鼠或人細胞在2×107濃度時其存活率應在90%以上。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μl抗體稀釋度更加堅強，再加入50μl細胞懸液與時俱進，混勻。
(2)冰浴45分鐘初步建立，離心滴定板(1500r/min10分鐘)綜合運用。
(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μl洗滌細胞沉淀2次的方法，每次洗滌后用1500r/min10分鐘體系，棄上清。
(4)以1ml預冷的培養(yǎng)基配成1×106細胞/ml的已染色細胞懸液帶動產業發展，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)責任製。
目前流式細胞儀(FCM)已在各學科中獲得應用十分落實。
①細胞生物學：定量分析細胞周期并分選不同細胞周期時相的細胞;分析生物大分子如DNA、RNA規則製定、抗原製造業、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細胞增殖周期的關(guān)系，進行染色體核型分析關規定，并可純化X或Y染色體發展基礎。
②腫瘤學：DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標建強保護。近年來已應用DNA倍體測定技術(shù)同期，對白血病、淋巴瘤及肺癌真正做到、膀胱癌科普活動、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細胞強化意識。
③免疫學：研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關(guān)系;進行免疫活性細胞的分型與純化;分析淋巴細胞亞群與疾病的關(guān)系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷;器官移植后的免疫學監(jiān)測等長期間。
④血液學：血液細胞的分類、分型現場，造血細胞分化的研究高端化，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶我有所應、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關(guān)系提單產，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴重溶血;檢測血液中循環(huán)免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病至關重要，如紅斑狼瘡等發展空間。
⑤藥物學：檢測藥物在細胞中的分布，研究藥的作用機制有所應，亦可用于篩選新藥足了準備，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰著力提升，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等深刻內涵。