熒光定量PCR(qPCR)是以熒光為基礎的定量分析技術(shù)設計標準,應用非常廣泛的過程中,可以用于定量RNA的豐度(RT-qPCR)發展契機,驗證芯片或測序的數(shù)據(jù),確定病原體的載量促進進步,進行基因分型等等發力。
熒光定量PCR儀負責監(jiān)控反應體系中熒光強度的變化優勢領先,記錄檢測熒光達到閾值時的循環(huán)數(shù)(被稱為Ct或Cq值)。從理論上說共創美好,每一個qPCR循環(huán)會使目標序列翻倍改善,因此人們可以在Ct值的基礎上對樣本進行定量。
在進行熒光定量PCR時協調機製,我們往往會面臨眾多選擇信息化,每一步選擇都影響著實驗的zui終結(jié)果。好在市面上的qPCR產(chǎn)品也種類繁多向好態勢,可以滿足我們的各種需求平臺建設。
染料法VS探針法熒光定量PCR主要分為染料法和探針法兩種。染料法一般采用DNA染料SYBR?Green(或Promega的BRYT?Green等)貢獻力量,這種方法不僅使用簡單使用,成本也zui低。不過染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA發行速度,不具有序列特異性更加堅強。為此,一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標準性能,用來校正背景初步建立。
成本低是染料法qPCR的一個主要優(yōu)勢,DNA染料相對比較便宜供給,而且適用于任何序列的方法。不過染料法無法在同一個樣本中檢測多個指標,也難以鑒定擴增得到的序列進行探討,會受到脫靶效應(如引物二聚體)的影響落到實處。在這種情況下,就需要進行熔解曲線分析最新,判斷擴增所得產(chǎn)物是否只有一種技術創新。