三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是一種通過構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu)逐漸完善，模擬細(xì)胞在體內(nèi)自然微環(huán)境的體外培養(yǎng)技術(shù)情況較常見，旨在彌補(bǔ)傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間的差距創造性，為細(xì)胞提供更接近生理狀態(tài)的生長(zhǎng)條件引領作用。該系統(tǒng)核心在于通過支架材料或無支架技術(shù)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)更優美。支架材料包括天然的膠原的特點、Matrigel及合成材料如聚乳酸規模、聚苯乙烯等不要畏懼，它們通過調(diào)整孔隙率長足發展、力學(xué)性能支持細(xì)胞黏附今年、遷移及功能表達(dá)。無支架技術(shù)則包括懸滴法結構不合理、磁力懸浮等動手能力，利用重力或磁場(chǎng)使細(xì)胞聚集成球逐步改善。

　　三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)有多種類型，常見的包括基于基質(zhì)膠提升、細(xì)胞外基質(zhì)支架大大提高、微流控芯片以及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)等，不同系統(tǒng)操作方法有所差異研究成果。以下是一些常見三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的操作指南：

　　1取得了一定進展、基于基質(zhì)膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備基質(zhì)膠、適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基大面積、細(xì)胞積極參與、24孔板或6孔板等實(shí)驗(yàn)耗材。

　　基質(zhì)膠預(yù)處理：將基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出培養，置于4℃冰箱過夜融化交流研討。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，按一定比例與培養(yǎng)基混合稀釋方案，如1:10應用的選擇。將稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在培養(yǎng)板孔中，每孔約200-300μL即將展開，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使其覆蓋孔底大幅增加，再將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘傳承，使基質(zhì)膠形成凝膠狀基底等特點。

　　細(xì)胞接種與培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來，用含血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液多種。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將進一步，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整細(xì)胞密度，一般建議在5×10?-1×10?個(gè)/mL發展成就。將細(xì)胞懸液均勻接種到鋪好基質(zhì)膠的培養(yǎng)孔中成就，每孔約200-300μL，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布開展面對面，然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)系統，定期更換培養(yǎng)基。

　　實(shí)驗(yàn)觀察與分析：通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化進一步提升，記錄生長(zhǎng)空間廣闊、增殖情況。還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母母飫撔?，采用MTT實(shí)驗(yàn)知識和技能、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行檢測(cè)，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2實現、基于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和Transwell系統(tǒng)的三維細(xì)胞培養(yǎng)

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備Matrigel或其他ECM不容忽視、預(yù)冷無菌1.5ml離心管、Transwell插入（24孔或12孔服務體系，根據(jù)細(xì)胞大小選擇孔徑）說服力、適配多孔板、細(xì)胞系或類器官模型問題、培養(yǎng)基逐漸顯現、無菌移液器與槍頭、無菌PBS緩沖液等系統穩定性。

　　ECM預(yù)處理：將ECM懸浮液從冰箱取出保持在冰上，用預(yù)冷移液器移取適量分裝到離心管中法治力量。然后將少量ECM加入到Transwell系統(tǒng)的下腔室底部全技術方案，涂布均勻，放入37℃溫箱孵育30分鐘使其固化共享。

　　細(xì)胞或類器官懸液制備：胰酶消化細(xì)胞后重懸于培養(yǎng)基中信息化，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至1-5×10?cells/ml。若為類器官生動，先用ECM包被新型儲能，再輕輕重懸至ECM中并調(diào)整濃度。

　　Transwell插入預(yù)處理：在每個(gè)Transwell插入的內(nèi)腔中加入50-100μl的ECM新品技，確保覆蓋孔膜表面範圍，孵育30分鐘至固化。

　　細(xì)胞或類器官接種：將細(xì)胞懸液或類器官懸液滴加到Transwell插入的內(nèi)腔中紮實做，然后向上腔室和下腔室加入合適的培養(yǎng)基空間廣闊，注意避免氣泡產(chǎn)生。

　　培養(yǎng)與維護(hù)：將多孔板放入37℃提供深度撮合服務、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)服務品質，每隔2-3天更換上腔室和下腔室的培養(yǎng)基，更換時(shí)小心吸除舊培養(yǎng)基組成部分，避免擾動(dòng)細(xì)胞或類器官影響。

　　分析與記錄：定期用顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況，記錄圖像和形態(tài)學(xué)變化的過程中。還可根據(jù)需求收集細(xì)胞或類器官發展契機，用于免疫熒光、qPCR等功能分析國際要求，同時(shí)記錄培養(yǎng)情況和相關(guān)數(shù)據(jù)流動性。

　　3、微重力3D旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

　　系統(tǒng)安裝：將回旋主機(jī)放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，確保旋轉(zhuǎn)座與培養(yǎng)箱內(nèi)壁至少保留10cm間隙持續創新。使用配套扁平電纜連接控制器與主機(jī)改善，注意接口防塵。接入220V交流電協調機製。

　　參數(shù)設(shè)置：通過控制器觸屏選擇重力模式信息化，如微重力（1-4rpm）或超重力（2-5g），還可設(shè)置定時(shí)啟動(dòng)實踐者、旋轉(zhuǎn)速度梯度變化等程序平臺建設。

　　培養(yǎng)容器準(zhǔn)備：若為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，可使用T25培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)壁式EP管反應(yīng)器貢獻力量，注意培養(yǎng)基充注量使用。進(jìn)行3D球體培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)化細(xì)胞密度發行速度，如5×10³-1×10?cells/mL更加堅強，添加低血清培養(yǎng)基。

　　系統(tǒng)啟動(dòng)與監(jiān)測(cè)：?jiǎn)?dòng)系統(tǒng)后性能，通過重力傳感器查看X/Y/Z軸重力數(shù)值初步建立，確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定。系統(tǒng)支持37°C供給、5%CO?培養(yǎng)箱環(huán)境的方法，需提前校準(zhǔn)溫濕度參數(shù)。

　　注意事項(xiàng)：控制器需遠(yuǎn)離強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境進行探討，啟動(dòng)前確認(rèn)旋轉(zhuǎn)框無阻擋落到實處。定期用75%酒精擦拭旋轉(zhuǎn)座表面，防止污染再獲，且定期對(duì)重力傳感器校準(zhǔn)產品和服務。

　　4、基于水凝膠的三維細(xì)胞培養(yǎng)（以CulXⅡ型為例）

　　材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備CulXⅡ型水凝膠凍干粉體驗區、細(xì)胞培養(yǎng)基增多、待培養(yǎng)細(xì)胞。

　　水凝膠制備：根據(jù)需要加入一定量的細(xì)胞培養(yǎng)基溶解凍干粉有望，如加入5ml培養(yǎng)基進一步推進，使用平頭移液槍頭輕輕吹打至凍干粉充分分散，然后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中方案，渦旋30-60秒至完q溶解應用的選擇。隨后4000轉(zhuǎn)離心5分鐘除去氣泡。

　　細(xì)胞接種：將混合溶液加入沉淀的待培養(yǎng)細(xì)胞中重懸細(xì)胞左右，并調(diào)整到所需細(xì)胞濃度背景下，對(duì)于類器官培養(yǎng)綜合措施，推薦細(xì)胞密度為5×10?到1×10?左右。將得到的混合懸液接種到無TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)板自然條件。

　　培養(yǎng)與換液：將培養(yǎng)板放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)設計標準。換液時(shí)可采用回收重懸換液或半量換液兩種方式×α?；厥罩貞覔Q液即吸取培養(yǎng)體系我有所應，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘深入實施，沉淀回收細(xì)胞至關重要，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后加入培養(yǎng)容器。半量換液則是取出一半體積的培養(yǎng)體系效果，加入另一培養(yǎng)孔有所應，再用同樣支架濃度的培養(yǎng)液補(bǔ)滿并吹打混勻。

　　細(xì)胞回收：吸取培養(yǎng)體系置于無菌離心管內(nèi)快速融入，加入緩沖液或培養(yǎng)基稀釋10倍認為，混勻后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，即可沉淀回收細(xì)胞增強。