熒光定量PCR儀技術(shù)原理

將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后領域，完成高溫變性處理，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)高質量，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律十分落實，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷倍增效應，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光製造業，隨著循環(huán)次數(shù)的增加優化服務策略，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度發展基礎，求得Ct值兩個角度入手，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)同期。

Ct 值

Ct值（Cycle threshold生產效率，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1. 熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺适褂?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍情況較常見，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值與起始模板的關(guān)系

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下主要抓手。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)機製，X0為初始模板量，Ex為擴增效率集成應用，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多不負眾望，Ct值越小高效流通。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)精準調控，縱坐標(biāo)代Ct值功能。因此，只要獲得未知樣品的Ct值解決，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)預期。

熒光化學(xué)物質(zhì)

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針幅度，該探針為一寡核苷酸結構，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時貢獻，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收規模最大；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解統籌，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離最深厚的底氣，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈振奮起來，就有一個熒光分子形成品質，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析深入各系統，又可分析基因突變（SNP）解決問題，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中作用，加入過量SYBR熒光染料環境，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號高質量，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號應用情況，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線表現，確定PCR反應(yīng)是否特異特點。

3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對結論，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近和諧共生，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后適應性強，退火過程中技術交流，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光[2]  拓展。